AISLAMIENTO, ESPORULACIÓN y PATOGENICIDAD DE Phytophthora sp. EN MANZANA ANNA SOBRE PATRÓN MM106 EN CALDAS.
Bernardo Villegas E. I.A. Candidato a M.Sc.INTRODUCCIÓN
Una de las enfermedades más importantes del manzano (Malus domestica Borkh.) en el departamento de Caldas, es la Pudrición del cuello y raíz causada por Phytophthora spp. Esta enfermedad ha aumentado paulatinamente en los últimos años, debido al uso de portainjertos susceptibles como el MM106, a la siembra en suelos mal drenados y al exceso de humedad en el pie del árbol (Ferree y Carlson, 1987). Debido a que la pudrición de la corteza puede ser producida por diversas causas, el aislamiento del patógeno es esencial para realizar un diagnóstico correcto (Harris, 1991 ). El aislamiento de Phytophthora de tejidos Infectados en descomposición es extremadamente difícil, pero puede ser exitoso si se emplean métodos especiales (Tsao, 1987), como medios selectivos de cultivo tales como el PVP, conformado por harina de maíz agar (HMA) con la adición de los fungicidas pentacloronitrobenceno (PCNB) y pimaricina y el antibiótico vancomicina (Tsao y Ocaña, 1969; Aldwinckle et al., 1975) y el PAR, conformado por HMA, el fungicida pimaricina y los antibióticos amplc!lina y rifampicina (Jeffers y Martin, 1986); también se puede adicionar himexazol (tachigaren), para evitar crecimiento de Oomycetes y Zygomycetes, principalmente Pythium y Mortierella (Tsao, 1987).
También se han utilizado varios tipos de trampas para obtener Phytophthora del suelo y de tejido enfermo; en tales casos se han empleado frutos de manzana y pera, plántulas de cártamo (Carthamus tinctorius L.) y hojas de algunas variedades de durazno (Tzao, 1987). Otros investigadores han utilizado tejido enfermo (Sewell y Wilson, 1964) y suelo contaminado (Campbell, 1949) introduciéndolo dentro de frutos de manzano y obtienen Phytophthora de la pudrición generada.
La producción de esporangios y zoosporas es el principal medio para incrementar la cantidad de unidades infectivas y par::¡ propiciar una rápida regeneración de especies de Phytophthora La esporulación, al menos en especies del suelo, requiere de un estricto control de las condiciones ambientales, la cual puede inducirse en medios naturales
tales como agar o caldo de jugo V8 clarificado, medio de semilla de frijol y agar de semilla de cáñamo, y en medios artificiales como solución de Petri, solución de sales de Schmitthenner y solución de sales de Chen y Zentmyer. También se han aplicado técnicas de lavado a través de papel filtro, clarificación de medios, centrifugación, inundación con agua destilada, lavados repetitivos y agitación permanente de caldos de cultivo, entre otros (Erwin y Ribeiro, 1996).
Para determinar la patogenicidad de Phytophthora se pueden inocular varios órganos de la planta con suspensiones de esporas, discos de agar con el hongo, material vegetal enfermo o con suelo infestado y el daño obtenido puede ser medido por el tamaño de la lesión (Shearer et a/., 1988), teniendo en cuenta Jos postulados de Koch. Debido a que hasta el momento en los cultivos de manzano en el departamento de Caldas no se habían realizado aislamientos de Phytophthora, razón por la cual no se había comprobado su patogenicidad, se realizó el presente estudio con el fin de: 1 ) Determinar el método de ~islamiento más efectivo de Phytophthora sp. de árboles enfermos de manzano, 2) Desarrollar un procedimiento para producir gran cantidad de esporangios de Phytophthora sp. y una forma práctica para extraerlos del medio de cultivo y 3) Evaluar inicialmente la patogenicidad de Phytophthora sp.
MATERIALES y MÉTODOS
Aislamiento, En la finca "Floridablanca" del municipio de Villamaría, se obtuvieron muestras de árboles de manzana Anna sobre patrón MM106, que mostraban síntomas típicos de pudrición del cuello de la raíz, para lo cual se extrajeron porciones de tejido sano y enfermo (2.0 x 1.0 cm aproximadamente) del borde de la lesión. Adicionalmente se tomaron 250 g de suelo de la zona aledaña a la pudrición.
Método directo: En el laboratorio las muestras de tejido se llevaron a la cámara de aislamientos, se dividieron en trozos de 7.0 x 3.0 m m aproximadamente y se desinfestaron mediante inmersión en etanol del 70% durante 30 s, luego se lavaron durante 1 min con agua destilada estéril y se secaron con papel secante estéril La mitad de los trozos se sembró en cajas de Petri con medio selectivo PAR, al cual se le adicionó iprodione (rovral PM50) a 100 mg.L-1 y se dejaron en completa oscuridad a temperatura ambiente (20 -23°C).
Método indirecto o trampa: La otra mitad de los trozos de tejido se introdujeron en orificios de 5 m m de diámetro y 30 m m de profundidad, hechos en frutos maduros de manzana Anna, luego se cubrieron con cinta de enmascarar y se dejaron a temperatura ambiente. De ia muestra de suelo se tomó una porción que fue introducida en orificios hechos en frutos como ya se indicó; el resto del suelo se esparció en un recipiente de base ancha, formando una capa de 1 cm de altura, ruego se colocó un fruto maduro de manzana var. Anna, en posición horizontal y se le adicionó agua destilada hasta cubrir la mitad de este.
De las pudriciones obtenidas en los frutos se tomaron porciones de pulpa de 3-4 m m del borde de la lesión y se sembraron en medio selectivo similar al empleado en el método directo.
Esporulación. Aunque la literatura reportaefuso de técnicas complejas para obtener esporulación de especies de Phytophthora, se utilizó un procedimiento sencillo en el que se combinaron varias técnicas (Chen y Zentmyer, 1970; Hwanget al., 1975 y Halsall, 1977, citados por Erwin y Ribeiro, 1996). Se vertieron 10 m I deagar jugo V8 (Tuite, 1969) compuesto de 200 m I de jugo V8 (Campbell Soup Co. ), 3g de CaCO3, 15g de agar y 800 m I de agua destilada, en cajas de Petri de 100 x 16 mm. Se sembró el hongo y se dejó a temperatura ambiente y en oscuridad hasta que el micelio alcanzó el borde de la caja; después se inundó con 20 m I de agua destilada estéril y se dejó en presencia de luz fluorescente, a temperatura ambiente, durante 10 a 15 días.
Patogenicidad. Para este estudio preliminar se vertieron asépticamente 30 mI de medio HMA en frascos erlenmeyer de 500 m I En unos se sembró un aislamiento de P. cactorum (Procedente de fresa, Corpoica Tibaitatá) como testigo relativo, en otros uno de Phytophthora sp. procedente de cultivos de manzano y un testigo absoluto, con tres repeticiones. Ocho días después, cuando las colonias habían cubierto todo el medio, en cada frasco se insertó una. pjántula de MM106 en crecimiento activo, previamente desinfestada con benomyl (benlate WP) a 19.L-1 y podada en las raíces secundarias y principal. Veinte días después se inundaron con 10 m I de agua destilada estéril para estimular la formación de esporangios y 25 días más tarde, se tomaron muestras de tejido con síntomas de la enfermedad, se desinfestaron y se sembraron como se indicó en el método directo de aislamiento.
RESULTADOS y DISCUSIÓN
Aislamiento. La obtención de Phytophthora sp. de muestras de tejido y suelo sólo fue exitosa en el método directo. De 18 muestras de tejido se obtuvieron siete aislamientos, de los cuales uno correspondió a Phytophthora y el resto a pythium. Por el método indirecto únicamente se obtuvieron aislamientos de pythium en el 100% de los casos. El método directo, a pesar de haber tenido éxito solo en el 5.6% de los casos, ofrece mejores posibilidades de obtener Phytophthora porque el riesgo de crecimiento de otros hongos similares más agresivos, como pythium y Morlierel/a, es mucho menor que con el método indirecto, ya que en éste el contacto del tejido o el suelo con e! fruto también favorece el desarrollo de estos hongos. Aunque la presencia de hi~exazol en el medio selectivo inhibe el crecimiento de pythium y Morlierel/a, su uso no es conveniente por la sensibilidad de Phytophthora cactorum a dicho compuesto \Hansen et al., 1979), y menos para aislamientos provenientes de manzano, ya que en este cultivo dicho patógeno es el principal causante de la Pudrición del cuello y raíz a nivel mundial (Harris, 1991 ). El fungicida iprodione puede reemplazar el himexazol aunque solo inhibe pythium proliferum (Erwin y Ribeiro, 1996).
Esporulación. El resultado permitió la obtención de 8.00010.000 esporangios.mr1 y 6.000-8.000 oosporas.mr1, los cuales se extrajeron raspando suavemente con un asa la superficie del medio. La liberación de zoosporas se produjo 15 días después de la inundación. El éxito se debió a la utilización del agar jugo V8, que induce la esporulación del hongo (Halsall y forrester, 1977 citados por Erwin y Ribeiro, 1996) ya la inundación, que estimuló la formación de esporangióforos y esporangios hacia la superficie del agua, en búsqueda del oxígeno del aire (Erwin y Ribeiro, 1996).
Patogenicidad. En dos de las tres plántulas insertadas en medio con Phytophthora sp. se observaron síntomas típicos de la enfermedad, con necrosis del tejido de 1.5 y 4.0 cm de longitud. Del 50% de las muestras de tejido cultivadas en medio selectivo se recuperó el hongo. Las plántulas insertadas en medio con Phytophthora cactorum no mostraron síntomas de enfermedad debido probablemente a la pérdida de virulencia por la multiplicación frecuente en medios de cultivo. El testigo tampoco mostró síntomas de la enfermedad.
Actualmente se está haciendo una evaluación de la patogenicidad de especies de Phytophthora y pythium, para determinar la importancia de este último y su interacción con los cultivos de manzano en la zona.
BIBLIOGRAFíA
ALDWINCKLE, H.S., POLACH, F.j., MOLIN, W.T and PEARSON, R.C. 1975. Pathogenicity of Phytophthora cactorum isolatesfrom New York apple trees and other sources. Phytopathology, 65.989-994.
CAMPBELL, W .A. 1949. A method of isolating Phytophthora cinnamomi directly from soil. Plant Disease Reporter, 33.134-135.
ERWIN, D.C. and RIBEIRO, O.K. 1996. Phytophthora diseases worldwide. American Phytopathological Society, APS Press, st. Paul, MN. 562pp.
FERREE, D.C. and CARLSON, R.F. 1987. Apple rootstocks In. Rootstocks for fruit crops. R.C. Rom and R.F. Carlson, Eds. WileyInterscience, NY. 494pp.
HANSEN, E.M. HAMM, P.B. jULIS, A.j. and ROTH, L.F. 1979. Isolation, incidence and management of Phytophthora in forest tree nurseries in the Pacific Northwest. Plant Disease Reporter, 63:607-611.
HARRIS, D.C. 1991. The Phytophthora diseases of apple. The journal of Horticultural Science, 65:513-544.
jEFFERS, S.N. and MARTIN, S.B. 1986. Comparison of two media selective for Phytophthora and pythium species. Plant Disease, 70.10381043.
SEWELL, G.W.F. and WILSON, j.F. 1964. Death of maiden apple trees caused by Phytophthora syringae Kleb. and a comparison of the pathogen with P. cactorum (L. & C.) Schroet Annals of Applied Biology, 53:275-280
SHEARER, B.j. MICHAELSEN, B.j. and SOMERFORD, P.j. 1988. Effects of isolate and time of inoculation on invasion of secondary phloem of Eucalyptus spp. and Banksia grandis by Phytophthora spp. Plant Disease 72:121-126.
TSAO, P.H. 1987. Factors affecting isolation and quantitation of Phytophthora from soil. Pgs 219-236 In. Phytophthora Its Biology, Taxonomy, Ecologyand Pathology. DC. Erwin, S Barnicki-Garcia and P .H. Tsao, eds. American Phytopathological Society, St. Paul, MN. 392p.
TSAO, P.H. at:1d OCAÑA G. 1969. Selective isolation of species of Phytophthora from natural soils on an improved antibiotic medium. Nature, '223:636-638.
TUITE, j. 1969. Plant pathological methods-fungi and bacteria. Burgess Publishing, Minneapolis, MN. 239pp
