METODO RAPIDO DE DIAGNOSTICO DE Mycosphaere/1a musicola LEACH y M. fijiensis MORELET, AGENTES CAUSALES DE LA SIGATOKAS AMARILLA y NEGRA DEL PLÁTANO1.
Martha Cecilia Aguirre Gaviria, I.A., Jairo Castaño-Zapata, Ph.D. y Luis Eduardo Zuluaga Arias, Auxiliar de investigación..INTRODUCCIÓN
Mycosphaerella musicola leach [ anamorfo Pseudocercospora musae (A. Zimmerm) Deighton, sin. Cercospora musae A. Zimmerm.] y Mycosphaerella fijiensis Morelet (sin. M. fijiensis var. diffonnis Mulder & Stover) [anamorfo Paracercospora fijiensis (Morelet) Deighton, sin. Cercospora fijiensis Morelet y Pseudocercospora fijiensis (Morelet) Deighton], son los agentes causales de las Sigatokas amarilla y negra de las musáceas, respectivamente (Fullerton, 1994).
La Sigatoka amarilla, conocida previamente como enfermedad Sigatoka, toma su nombre del valle Sigatoka, Isla de Viti levu" Fiji, en donde la enfermedad se reconoció por primera vez en 1902. En 1912, ocasionó grandes pérdidas en Fiji, principalmente en el valle de Sigatoka. Otros registros sobre daños causados a la industria bananera por esta enfermedad han sido en 1924 en Australia, en la década de 1930-1940 en Centro América, islas 'del Caribe y Suramérica, como también en Africa (Mourichon y Fullerton, 1990). Posteriormente se registró su presencia en casi la totalidad de las regiones productoras de musáceas del mundo y ha sido considerada una de las enfermedades más devastadoras del cultivo.
La Sigatoka negra, se describió como una enfermedad nueva en 1963, también en Fiji (Rhodes, 1964; leach, 1964), aunque hay evidencias de su presencia en Hawai y en algunas zonas del Pacífico desde mucho antes (Stover, 1972). En Centroamérica , se describió por primera vez en Honduras en 1972 y desde allí se díseminó por el resto de la región. En Suramérica, se registró por primera vez en Colombia en 1981 , posteriormente en Ecuador en 1989 y más recientemente en Cuba y Venezuela (Mourichon y Fullerton, 1990). Aunque macroscópicamente los síntomas ocasionados por ambas enfermedades en el campo pueden indicar diferencias, éstas no son suficientemente nítidas para distinguirlas con precisión (Du Pont, 1980). Microscópicamente, los peritecios del estado sexual de M. musicola y M. fijiensis, son muy parecidos y se localizan inmersos en el tejido necrosado de las lesiones, midiendo aproximadamente 51-86 x 35-77~. El estado asexual de M. musicola forma estromas (esporodoquios) tanto en la haz como en la envés de las hojas, siendo más abundantes sobre la haz, y los conidios no tienen cicatriz (hilio) en el punto de unión con el esporodoquio; mientras que el estado asexual de M. fijiensis, produce conidióforos simples con cicatriz tanto en la base de los conidios como en los conidióforos (Castaño y del Río, 1994). En ambas especies los conidios son alargados, septados, hialinos y aciculares. De acuerdo con lo anterior, los estados sexuales de M. musicola y M. fijiensis, son indistinguibles. Ambos microorganismos se distinguen principalmente a través de diferencias morfológicas de sus an~morfos, en particular, las características de los conidióforos y conidios, especificamente por la presencia de cicatrices en los conidióforos y conidios de M. fijiensis, ausentes en M. musicola (Fullerton, 1994). la abundancia de estromas y conidios de P. fijiensis, en la parte inferior de las lesiones y de P. musae en la parte superior, también sirve como guía rápida para la identificación de estas especies (Fullerton, 1994). Por consiguiente, la identificación correcta de estos hongos depende de estudios de laboratorio.
Esta investigación tuvo como objetivo principal establecer una metodología simple que permitiera el diagnóstico rápido de M. musicola y M. fijiensis bajo condiciones de laboratorio.
MATERIALES y MÉTODOS.
El método es una modificación de la técnica empleada por lalancette et al. (1984) y consiste en utilizar jeringas de plástico desechables de 6 cm3, marca Precision Glide 21 G 1 112 , o similares, a las cuales se les remueve el extremo anterior para utilizarlas como cilindros, cuya área de la abertura es de 123. 7 mm2. los dispensadores se llenan con agar-crístal violeta más estreptomicina y benomyl (Agar bacteríológico Oxoid 1.5 g, estreptomicina en discos Oxoid 10 ug, benomyl 100 ppm, solución pura de cristal violeta al 1% en 100 ml de agua). la estreptomicina, el benomyl yel cristal violeta se añaden al medio líquido previamente esterilizado a 121aC y 15 lb de presión durante 20 min, antes de dispensar el medio en las jeringas; luego se colocan en posición vertical en una gradilla y se mantienen a 4°C en un refrigerador, para que el medio se solidifique rápidamente.
Para remover en el campo los conidios de P. musae ó de P. fijiensis, se presiona el émbolo de la jeringa hasta que quede expuesta una capa de medio d~ aproximadamente 2 m m de espesor. La superficie húmeda del agar-cristal violeta se presiona suavemente sobre un área necrosada de la hoja más joven. Luego el disco de agar-cristal violeta se corta cuidadosamente con un bjsturí de tal manera que forme una superficie lisa. Se colocan dos discos por lámina portaobjetos, y estas se van depositando dentro de una bandeja con tapa que contiene papel toalla humedecido, con el propósito de crear una cámara húmeda para inducir la difusión rápida del colorante a través de las células de los conidios muestreados y evitar la deshidratación del medio. De cada jeringa se pueden obtener 20-24 discos, suficientes para 10-12 muestras repli~adas dos veces.
Utilizando esta metodología el investigador establece una correspondencia entre el número de discos y el número de lesiones muestreadas, asi como entre el número de láminas portaobjetos y el número de hojas muestreadas. En este caso una lámina portaobjetos por material evaluado. Las láminas portaobjetos se montan inmediatamente sobre el microscopio compuesto para observar las características morfológicas de los conidios muestreados a través del objetivo 40X.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN. La ausencia de cristal violeta en el medio dificulta la diferenciación de los conidios de P. musae y P. fijiensis. El empleo de cristal violeta al 1% permite diferenciar de inmediato las dos especies. El colorante tiñe los conidios, siendo la coloración más intensa en la cicatriz (hilio) o punto de inserción de los conidios con el conidióforo, presente en P. fijiensis y ausente en P. musae.
La adición al medio de estreptomicina y benomyl evita la contaminación por bacterias y la germinación de los conidios, cuyo tubo germinativo podria interferir con las observaciones al microscopio. En estudios sobre monitoreo de resistencia de estos hongos a fungicidas, basta con suprimir el benomyl.
Un método similar al descrito adicionando o no lactofenol a agar al 1.5%, fue empleado por jacome y Schuh (1993), para monitorear conidios de M. fijiensis. Debido a que el lactofenol es incoloro, el color de los conidios no se altera dificultándose la caracterización de la especie. Aunque Tapia (1993), ha descrito una metodologia para cuantificar y caracterizar las estructuras reproductivas asexuales de ¡\11. musicola y M. fijiensis con base en características de estro mas y conidióforos, el método es demasiado tedioso ya que requiere 84 horas para procesarloslejidos muestreados en el campo y la diferenciación de especies no considera las caracteristicas descritas de los conidios de ambos hongos. Es de anotar que e) 1ratamiento térmico descrito por Tapia (1993), dispersa los conidios del hongo haciéndose aún más difícil su observación; además, no permite establecer una relación precisa del número de conidios presentes en los tejidos muestreados en el campo. Las dos especies de Mycospaerella, también se pueden diferenciar fácilmente a través de las características de las colonias en medio de cultivo, pero es demasiado demorado ya que se requieren unos 10 días (Du Pont, 1980). Así mismo, ambas especies también se pueden diferenciar mediante técnicas moleculares, tales como la de medición de la longitud polimorfa de fragmentos de restricción de ADN (RFLP) (Carlier et al., 1994) y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (johanson y jeger, 1993), pero su utilización es muy costosa.
La técnica desarrollada en esta investigación, además de permitir la identificación rápida y segura de los agentes causales de las Sigatokas amarilla y negra, permite obtener una gran cantidad de muestras a un mínimo costo.
BIBLIOGRAFIA
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